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隨著經濟的快速發展，許多發達地區的城市受納水體發生嚴重污染，環境容量變得非常有限。這些地區的城市污水處理廠即使執行《城鎮污水處理廠污染物排放標準》(GB18918-2002)一級A標準，氨氮(NH4+-N)和總氮(TN)也高于地表水V類標準的限值，污染物的累積將使得污染難以得到控制。因此，控制城市污水處理廠出水達到國家《地表水環境質量標準》(GB3838-2002)的Ⅲ類水質是科學可行的策略。

污水廠排放滿足Ⅲ類水質要求，需達到ρ(TN)≤1.0mg·L-1， ρ(NH4+-N)≤1.0mg·L-1的極限脫氮水平。硝化良好的系統，NH4+-N的完全去除不成問題，而NO3--N因受限于尾水的基質濃度，通常成為極限脫氮的難點。尾水NO3--N的深度去除常需要投加外碳源來實現。近年來，關于外碳源的研究得到廣泛關注，許多新型碳源的研究也取得一定進展。固體碳源如天然纖維素物質、人工合成可降解高聚物聚己內酯(PCL)和聚丁二酸丁二醇酯(PBS)等，可實現緩慢釋放并容易控制，但通常需要較長的停留時間。以高濃度有機工業廢水、污泥水解液、垃圾滲濾液和餐廚廢棄物水解液為代表的新型液體碳源也引起廣泛關注。利用這些碳源符合可持續發展的原則，但預處理成本一般較高，投加量需精準控制，容易引入重金屬和有毒物質等，不適合尾水處理。考慮污水廠尾水深度脫氮在反應效率、安全性以及經濟性等方面的要求，采用甲醇、乙醇等傳統液態型單一碳源以及由這些單一碳源為基礎開發的復合碳源可能是較為合適的選擇。單一碳源通常較容易被利用，反應速率快，但也存在缺點，如甲醇具有毒性，乙醇運輸和貯存有一定安全隱患，乙酸鈉價格較高，葡萄糖反應速率較低，以及單碳源可能僅被少量微生物利用、容易造成菌群結構豐度下降等。而復合碳源可能會克服上述一些缺點和問題，近年來在商業碳源領域得到較多關注，但公開數據較少。關于單碳源和復合碳源在尾水深度脫氮系統的應用和對比研究還較少。

此外，通過投加碳源對尾水進行深度脫氮是一個長期的過程。外碳源作為生化反應和微生物生長的基質，其對微生物種群必然存在選擇作用，不同菌群也會影響系統反硝化性能。關于碳源對種群結構影響的研究還較少。本研究針對某實際污水處理廠面臨的碳源選擇問題展開，為充分對比碳源的性能，選取4種單碳源和4種復合碳源，對系統反硝化性能、微生物群落結構和碳源經濟性進行綜合對比，以期為污水處理廠的碳源選擇提供更多更全面的借鑒。

1、材料與方法

1.1 試驗水質及接種污泥

本試驗采用人工配水。在實驗室取自來水，加入硝酸鈉作為氮源，配制微量元素濃縮儲備液Ⅰ和Ⅱ(見表1)為微生物提供必要營養，每個反應器每周期投加濃縮儲備液Ⅰ和Ⅱ均為2.5mL。進水ρ(NO3--N)為14.33~17.71mg·L-1， ρ(NO2--N)為0~0.078mg·L-1.試驗過程為排除自來水攜帶的溶解氧(DO)對缺氧反硝化的影響，投加無水亞硫酸鈉脫氧。試驗種泥取自哈爾濱某城市污水處理廠二沉池，該處理廠未投加碳源，脫氮除磷性能穩定。接種后污泥MLSS為4000mg·L-1，MLVSS為1937mg·L-1.

本試驗所用復合碳源按相應單碳源理論COD當量，配制成同一濃度基準溶液(以COD計)。復合碳源的配比主要考慮配制容易、盡量增加葡萄糖比例以降低造價和突出結果差異性等問題，選擇1∶1和1∶3兩種體積比。4種復合碳源分別為乙酸鈉/葡萄糖(1∶3)、乙酸鈉/葡萄糖(1∶1)、乙醇/葡萄糖(1∶1)和乙醇/葡萄糖(1∶3)。本試驗過程，每周期固定投加碳源溶液10mL，通過控制外碳源的質量濃度，達到不同的進水碳氮比COD/ρ(N)，碳源投加量的變化即體現在COD/ρ(N)變化上。

1.2 試驗裝置

本試驗采用8個序批式(SBR)反應器，有效容積為2L，結構如圖1所示。8個SBR反應器分別編號為1~8號。1~4號反應器加入單一碳源，按順序分別為甲醇、乙醇、葡萄糖和乙酸鈉；5~8號反應器投加復合碳源，按順序分別為乙酸鈉/葡萄糖(1∶3)、乙酸鈉/葡萄糖(1∶1)、乙醇/葡萄糖(1∶1)和乙醇/葡萄糖(1∶3)。配有蠕動泵控制進水和外碳源，通過時間控制系統控制出水。設置攪拌裝置用于攪拌混合，在線監測pH和溫度，通過PLC控制系統處理信號，通過控制系統終端監測數據。

1.3 運行策略

(1)碳源投加量確定  試驗模擬實際污水廠經常采用的碳源投加方法和策略，即按照出水標準來調整碳源用量的反饋控制。以出水ρ(NOx--N)≤1mg·L-1為處理目標，標記ρ(NOx--N)達到1mg·L-1時的碳源投加量，計算反應速率和運行費用。根據文獻以及試驗前期在污水廠進行的初步試驗，確定單碳源系統初始COD/ρ(N)均為5，復合碳源系統初始COD/ρ(N)均為7.根據出水ρ(NOx--N)來調節COD/ρ(N)，若出水ρ(NOx--N)高于1mg·L-1，調高COD/ρ(N)；若出水ρ(NOx--N)低于1mg·L-1，調低COD/ρ(N)。每次調整COD/ρ(N)后，系統穩定時間不少于5個周期。

(2)試驗時間及高通量測序  單周期運行6h，每天運行一周期。每周期進水10min，缺氧攪拌270min，沉淀70min，排水10min，其余時間閑置，排水比50%。全程未控制溫度，水溫范圍17~19℃。試驗過程不排泥，部分污泥隨出水流失。單一碳源1~4號系統運行時間為70d，復合碳源5~8號系統，運行期為64d。試驗初期，取種泥樣品進行高通量測試；待系統穩定，單一碳源1~4號反應器于第65d及復合碳源5~8號系統第60d取樣，對污泥樣品進行高通量測試。

1.4 分析項目與測定方法

樣品采用標準方法測定：COD采用重鉻酸鉀快速測定法，由連華快速測定儀測定；NO2--N采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法；NO3--N采用麝香草酚分光光度法；pH值、ORP、DO和溫度由美國哈希在線測定儀監測。

采用16SrRNA高通量測序方法分析微生物種群結構。污泥取樣后，使用無菌離心管離心3min，采用冰袋低溫保存送至生工生物(上海)公司進行測序。樣品DNA提取采用E.Z.N.A。TM Mag-BindSoilDNAKit試劑盒(OMEGA)。采用通用引物341F(CCTACGGGNGGCWGCAG)和805R(GACTACHVGGGTATCTAATCC)對樣品16SrRNA中的V3-V4區進行擴增。PCR反應體系和擴增方法同文獻的報道。擴增后的DNA進行回收純化，利用Qubit3.0DNA檢測試劑盒對其精確定量，最后利用IlluminaMiSeq平臺進行測序。

2、結果與討論

2.1 不同碳源系統的脫氮性能

不同碳源系統運行周期及脫氮性能見圖2。試驗結果表明，1~4號系統在COD/ρ(N)為8、5、10、7和5~8號系統在COD/ρ(N)為9、6、10、10分別達到ρ(NOx--N)≤1mg·L-1的處理目標。單碳源系統，2號系統在COD/ρ(N)為5時的處理效果與1、3和4號系統在COD/ρ(N)為8、10和7時的相當。而復合碳源系統，6號系統在COD/ρ(N)為6時的處理效果與5、7和8號系統在COD/ρ(N)為9、10和10時的相當。從5~8號系統出水ρ(NOx--N)曲線可以看出，在第27~33d，未改變反應條件，出水ρ(NOx--N)均出現升高。這主要是因為在這期間，未對原水進行脫氧處理。第33d之后繼續采取脫氧措施，出水ρ(NOx--N)出現明顯的下降。這說明，原水攜帶DO會造成外碳源浪費。實際工程從好氧池到缺氧池的內循環，經常會攜帶大量的DO，從節省碳源的角度，應采取措施盡可能降低DO的攜帶。

8個系統在最優COD/ρ(N)下，一個周期內ρ(NOx--N)變化如圖3所示。1~4號系統，從投加碳源開始到ρ(NOx--N)達到1mg·L-1的時間分別為45、20、80和25min，相應的平均速率分別為0.245、0.562、0.141和0.454kg·(m3 ·d)-1，NOx--N去除率分別為96.57%、98.87%、96.87%和98.34%。響應速度和反應速率最快的是乙醇系統。而葡萄糖系統，先出現一個短暫的平臺期，然后ρ(NOx--N)快速下降，第30min左右，反應速率再次出現下降。4個系統，投加葡萄糖外碳源，反應速率最慢，這與彭永臻等的研究結果一致，分析原因可能是因為葡萄糖代謝途徑較為復雜。

5~8號復合碳源系統，與單碳源系統相比，反應速率均出現較大程度下降。從反應開始，到ρ(NOx--N)到達1mg·L-1的時間分別為79、45、78和85min，平均反應速率為0.138、0.233、0.137和0.127kg·(m3 ·d)-1，NOx--N去除率分別為96.44%、97.56%、95.41%和94.78%。其中5、7和8號系統的反應速率均低于速率最低的3號系統。乙醇與葡萄糖組成復合碳源后，反應速率均低于乙酸鈉/葡萄糖組合，8號系統反應時間甚至高于葡萄糖單碳源系統。分析原因可能是由于乙醇是葡萄糖的發酵產物，其大量存在導致葡萄糖分解反應的推動力降低，反應速率變緩。

2.2 不同碳源系統污泥群落結構變化

2.2.1 微生物群落多樣性分析

對樣品進行高通量測序。種泥樣品編號為0，1~8號系統污泥樣品編號為1~8.首先利用多樣性分析(α)來反映群落豐度和多樣性， α多樣性指數的統計如表2所示。9組樣品的Coverage指數均大于0.99，說明可靠性非常高。

由表2可以看出，所有系統的Shannon指數均低于種泥樣本。這表明，投加外碳源，8個系統的群落多樣性均下降。這與李彭的研究結果相一致，其研究表明，城鎮污水深度反硝化系統內的微生物群落多樣性低于生物法二級處理系統，這可能是由單一的缺氧環境導致。考察群落豐富度，1~4號單碳源系統Chao和Ace指數與種泥相當，而5~8號復合碳源系統的Chao和Ace指數出現明顯的下降。根據本研究碳源組成，推斷葡萄糖是復合碳源系統群落豐富度降低的主要原因。

2.2.2 微生物群落結構分析

為進一步明確各系統菌群結構和豐度差異，對樣品在不同分類水平上進行類別及豐度分析。樣本中豐度占比小于1%的物種歸為others，其余作為優勢菌種進行分析。

2.2.2.1 門水平下微生物種類及豐度

樣品在門水平上的群落結構分析如圖4所示。從中可知，在種泥樣本中排名前10位的優勢菌門和相對豐度為：Proteobacteria(變形菌門，36.6%)、Bacteroidetes(擬桿菌門，21.45%)、Unclassified_Bacteria(未分類菌門，9.25%)、Planctomycetes(浮霉菌門，8.22%)、Chloroflexi(綠彎菌門，8.96%)、Acidobacteria(酸桿菌門，4.19%)、Verrucomicrobia(疣微菌門，2.93%)、Nitrospirae(硝化螺旋菌門，1.27%)、Firmicutes(厚壁菌門，1.25%)和Actinobacteria(放線菌門，1.42%)。

Proteobacteria菌群被證實為大部分污水廠的優勢菌群，能脫氮除磷并去除有機物，種泥豐度較高可能與其所在的污水處理廠具有較好的脫氮除磷性能有關。經不同碳源馴化后，種泥群落結構發生顯著變化。Proteobacteria除在甲醇污泥中略有增長外，在其余系統中均下降，在葡萄糖相關系統中下降程度最高，而相應的，CandidatusSaccharibacteria菌群在葡萄糖相關的系統增加也最為明顯。CandidatusSaccharibacteria菌門的相對豐度在種泥中為1.16%，在1~4號系統分別為0.35%、1.37%、46.4%和0.75%，而在5~8號系統中豐度分別為42.22%、31.91%、47.37%和43.51%。顯然，其在3、5、6、7和8號系統內均成為絕對優勢菌種。值得注意的是，4種復合碳源反硝化速率與單碳源相比均有降低，但在6號系統，CandidatusSaccharibacteria的相對豐度較低，而6號系統的反硝化速率、氮的去除效率相對較高，這也間接說明CandidatusSaccharibacteria菌門對提高反硝化速率可能不利。CandidatusSaccharibacteria菌群已被證實可在缺氧條件下降解有機物并對NO3--N進行還原，且可能是與短程脫氮密切相關的菌群。王維奇等曾在2018年首次報道，在葡萄糖作為基質的系統，CandidatusSaccharibacteria成為優勢菌種，并推測其對短程反硝化(NO3--N還原生成NO2--N)起主要作用，且傾向于好氧環境生存。Zhao等以溶解性淀粉做碳源，CandidatusSaccharibacteria發展成優勢菌屬；而有研究結果表明，復雜有機物可能有利于CandidatusSaccharibacteria的富集。本研究菌種選擇富集結果與王維奇等的結果高度一致，且所有與葡萄糖有關的系統出現相似結果，因此判定CandidatusSaccharibacteria菌門是由葡萄糖篩選富集，并適應缺氧條件。

在投加甲醇、乙醇和乙酸鈉系統中，Unclassified_Bacteria的相對豐度得到極大提高，而其它系統，Unclassified_Bacteria與種泥豐度相當，未有顯著變化。另外注意到，Firmicutes菌種，其作為無氧條件下重要的反硝化菌，彭永臻等的研究表明其在乙酸鈉碳源系統得到較高水平的富集，而本研究在乙醇、乙酸鈉系統以及4種復合碳源系統該菌群豐度均得到一定比例的提高，而在甲醇和葡萄糖單碳源系統比例非常低，這說明乙醇和乙酸鈉對該菌群的富集可能均起到促進作用。Bacteroidetes主要被發現于缺氧環境中，且在大部分污水廠占有較高豐度，能水解大分子，促進含氮物質的轉化等。Bacteroidetes在種泥中的豐度較高，而1~8號系統均出現下降，這表明，傳統易降解外碳源可能對富集該類菌種不利。Chloroflexi屬于堿性厭氧菌，該門下的一些細菌可以將NO3--N轉化為NO2--N。該菌屬在1、2和4號樣品中豐度維持較高水平，而在3、5、6、7和8號污泥樣品中均有一定下降，說明葡萄糖對其生長不利。Actinobacteria門生物被認為主要降解葡萄糖，不以NOx--N為電子受體，在單碳源系統該類菌群豐度水平較低，而在復合碳源系統，Actinobacteria門得到大幅度提高，且乙酸鈉/葡萄糖系統的Actinobacteria豐度明顯高于乙醇/葡萄糖系統，推斷復合類型的碳源對該類微生物的富集有促進作用。

2.2.2.2 屬水平下的群落結構及豐度

樣品屬水平群落結構及豐度如圖5所示。從中可知，變化最為顯著的是Saccharibacteria_genera_incertae_sedis菌屬，該菌屬屬于CandidatusSaccharibacteria門。在種泥中，其僅占1.51%，在1~8號系統其相對豐度與CandidatusSaccharibacteria菌門相當。CandidatusSaccharibacteria門高度富集情況下， Saccharibacteria_genera_incertae_sedis菌屬高度富集，這與已有的研究結果一致，不同的是Zhao等和霍小愛以溶解性淀粉為碳源。馬思佳等的研究發現，葡萄糖/蛋白胨和乙酸鈉/蛋白胨均促進了Saccharibacteria_genera_incertae_sedis的選擇富集，且葡萄糖/蛋白胨系統富集比例更高，推斷復雜類型碳源更有利于Saccharibacteria_genera_incertae_sedis富集。

在1、2和4號系統中優勢菌屬為unclassified_Bacteria(未分類細菌)，相對豐度分別為25.74%、25.84%和27.96%，而其在種泥中豐度為9.25%，分析認為，傳統碳源促進了復雜菌屬的生長。值得注意的是，1號甲醇系統， unclassified_Methylophilaceae的相對豐度大幅度增加，其屬于Methylophilaceae(嗜甲基菌科)，專性或嚴格兼性以甲醇或者甲胺為唯一碳源和能源。而高鑫華等的研究表明NOx--N會增加嗜甲基菌屬的豐度，且認為NOx--N可能和銨鹽一樣，作為營養物質參與反應，而非氧化還原反應中的電子受體。本研究可以確定甲醇是該菌種得到富集的主要原因，NOx--N是否對其有利尚無法證實。此外， Thaurea(陶厄氏菌屬)和Acinetobacter(不動桿菌屬)在4、5和6號乙酸鈉系統均有明顯的數量優勢， Thauera被證明是污水廠廣泛存在的重要反硝化菌，而Acinetobacter菌可能與一些系統的除磷和反硝化除磷有關，這些種屬在4、5和6號系統具有數量優勢，推斷和乙酸鈉有直接關系。 Zoogloea (動膠菌屬)在7號和8號系統顯著增加，其被認為與菌膠團形成有關，能以NOx--N為電子受體進行反硝化，某些研究也表明其具有好氧反硝化功能，對同步硝化反硝化(SND)具有促進作用。本試驗Zoogloea的變化表明，乙醇對其富集起重要作用。但由于反應過程為嚴格缺氧， Zoogloea不可能發揮好氧反硝化作用，只能參與缺氧反硝化，或者如文獻，其僅僅發揮污泥沉降功能。噬氫菌屬(Hydrogenophaga)屬于Proteobacteria，有研究認為Hydrogenophaga能進行反硝化，但很少利用碳水化合物作為碳源。本研究在1號甲醇系統Hydrogenophaga得到顯著增加，說明甲醇可能對其富集生長有利。

2.3 不同碳源經濟性分析

根據碳源投加量及碳源價格，對運行費用進行粗略估算，見表3.按照市場價格，4種單碳源中乙醇單價最高，但因其反硝化速率高，反應時間短，投加量省，其作為外碳源費用最低。投加乙酸鈉的系統，反應速率僅次于乙醇，但由于單位乙酸鈉折合的COD當量不高，其投加量較大，折算后的費用為最高。復合碳源系統，反硝化速率與單一碳源系統相比較低，但均能在一個周期內達到處理目標。根據碳源投加量計算得到的復合碳源運行費用，以乙酸鈉/葡萄糖(1∶1)為最低。實際污水廠因規模、工藝及設計參數等不同，碳源投加運行費用可能會有較大差別，需因地制宜地制定優化策略。

3、結論

(1)從系統反硝化效率看，投加單碳源和復合碳源，出水ρ(NOx--N)均能達到1mg·L-1以下的處理目標。投加乙醇單碳源的系統反應速率最快，乙酸鈉次之。若能解決安全運輸和貯存問題，乙醇為最優。單純考慮安全性及效率，投加乙酸鈉較為理想。乙醇與葡萄糖組成復合碳源后，在速率上未體現優勢；而乙酸鈉更適合與葡萄糖組成復合碳源，但葡萄糖比例不宜過高。考慮經濟性、安全性和反應速率，復合碳源乙酸鈉/葡萄糖(1∶1)較為優化。

(2)從微生物群落結構上看，碳源對菌群具有明顯的篩選作用，會導致優勢菌群發生根本性變化。在葡萄糖相關的系統中，CandidatusSaccharibacteri經過70d左右的選擇富集，成為絕對優勢菌門。相應的，在屬水平， Saccharibacteria_genera_incertae_sedis菌群占絕對優勢。多種碳源的對比試驗證明，葡萄糖對群落結構影響較大，可引起CandidatusSaccharibacteri菌門和Saccharibacteria_genera_incertae_sedis屬的高度富集，且此類菌群可在缺氧環境下生存。